УДК 579.258
Оценка представленности генов катаболизма ксенобиотиков в чистых культурах и микробиоценозах различными молекулярно-генетическими методами
М. Н. Круглова, А. А. Самков, Н. Н. Волченко, А. А. Худокормов
Кубанский государственный университет, Краснодар
В статье продемонстрировано наличие ряда генов катаболизма ксенобиотиков, а именно AtzA и amoA в геномах нокардиоморфных актиномицетов (актинобактерий), являющихся ключевыми доминантами во многих почвенных микробиоценозах. Методом классической ПЦР с электрофоретическим окончанием было установлено возможное наличие гена AtzA в чистых культурах Rhodococcus erythropolis B2 и 2А, а также наличие гена amoA в штаммах Rhodococcus spp. B3, B4 и Rhodococcus erythropolis 2А.
Количественная оценка представленности генов AtzA и amoA была проведена при помощи ПЦР в реальном времени на образцах тотальной ДНК, выделенной из донных отложений лимана Горький Каневского района. Для сравнения изменений представленности целевых генов в результате искусственного загрязнения различными ксенобиотиками, играющими роль индукторов соответствующих катаболических ферментов, в образцы ила вносили нефть и пестицид имидаклоприд. Было обнаружено что при амплификации с праймерами к гену AtzA при выбранном пороговом уровне флуоресценции, Ct для пробы из ила, загрязненного нефтью, составило 37, а для пробы из ила, загрязненного имидаклопридом – 42. При амплификации с праймерами к гену amoA при выбранном пороговом уровне флуоресценции, Ct для пробы из ила, загрязненного нефтью, составило 30, а для пробы из ила, загрязненного имидаклопридом – 29.
Для проверки влияния биоэлектрохимических процессов на представленность исследуемых генов, относительно таковой гена 16S рРНК, в образцы загрязненных донных отложений помещали анод микробного топливного элемента (МТЭ) бентосного типа, подключенный или не подключенный внешней цепью к катоду, размещенному в слое жидкости над донными отложениями. После месячной инкубации было обнаружено, что представленность гена AtzA в случае загрязнения ила и нефтью, и имидаклопридом была меньше всего в пробе ила между анодами и больше всего в пробе с анода, не подключенного к катоду. Представленность гена amoA, в случае загрязнения донных отложений нефтью, в иле была ниже всего, а в пробах с обоих анодов - выше и почти равна. При загрязнении имидаклопридом представленность гена amoA на подключенном аноде была выше, чем на отключенном, но меньше, чем в пробе ила между анодами. Таким образом, данные гены, характерные для родококков - ключевых доминантов микробиоценозов почв, были обнаружены в метагеномах анаэробных донных отложений, а их представленность зависела от электрохимических условий селекции микрофлоры и присутствия поллютанта.

Ксенобиотики, попадающие в окружающую среду способны аккумулироваться и оказывать токсическое воздействие на все компоненты биосферы. Наиболее успешной стратегией борьбы с ксенобиотиками является использование живых организмов, способных осуществлять их биодеградацию. Важнейшая роль в разложении загрязняющих веществ принадлежит микроорганизмам. Главным критерием данной способности выступает наличие разнообразных ферментов, катализирующих реакции модификации и деградации поллютантов. В связи с этим одним из критериев оценки способности экосистем к восстановлению может служить сравнение относительной представленности генов, ответственных за биодеградацию ксенобиотиков микроорганизмами.

Материалы и методы
Исследование было проведено на кафедре генетики, микробиологии и биохимии биологического факультета, а также физико-технического факультета КубГУ. Объектами исследования являлись гены биодеградации ксенобиотиков – AtzA, кодирующий атразинхлоргидролазу – фермент, который осуществляет первую ступень деградации атразина и amoA, кодирующий алкенмонооксигеназу.
Выделение тотальной ДНК из чистых культур Rhodococcus spp. F2, F5, Z5, K10, B2, B3, B4, B8, J2, J8, Rhodococcus erythropolis B2 и Rhodococcus erythropolis 2А проводилось с использованием набора diaGene3318. Для проведения ПЦР использовались реактивы из набора БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2х) и амплификатор Authorized Thermal Cycler (Eppendorf, Германия). Детекция результатов амплификации проводилась путем электрофореза в агарозном геле, с окрашиванием бромистым этидием. ПЦР проводилась для обнаружения генов AtzA и amoA, связанных с катаболизмом атразина и алкенов соответственно.
Количественную оценку представленности генов в природных образцах проводили методом ПЦР в реальном времени на приборе амплификатор Rotor-Gene Q (Qiagen, Австралия). Гуминовые кислоты, содержащиеся в иле, являются сильными ингибиторами ПЦР, поэтому для выделения ДНК из образцов ила использовался набор реагентов для метагеномных исследований «МетаГен/MetaGen» EW-002 производства «Синтол», подходящий для выделения нуклеиновых кислот из таких образцов. Для проведения ПЦР в режиме реального времени, в присутствии красителя SYBR Green I, использовали реакционную смесь «ПЦР-микс» М-427 производства «Синтол». 
Результаты и обсуждение
Были исследованы чистые культуры актинобактерий, которые являются ключевыми доминантами во многих почвенных микробиоценозах. Было установлено, что ген amoA присутствует в геномах штаммов почвенных актинобактерий Rhodococcus spp. B3, B4, а также у Rhodococcus erythropolis 2А, но наблюдались и неспецифичные продукты реакции. Ген AtzA, кодирующий атразинхлоргидролазу, присутствует в чистых культурах Rhodococcus erythropolis B2 и А2, хотя также наблюдалось и неспецифичные продукты амплификации. В штамме Rhodococcus sp. F2 единственный ПЦР-продукт по данной паре праймеров был больше заявленной длины и содержал около 1000 н.п., что может, среди прочего, быть связано наличием у штамма гомолога гена AtzA. В работе A.F. Umar (2012) показано, что не все бактерии, способные к деградации атразина, содержат ген AtzA, некоторые могут содержать ген AtzN, имеющий сходную функцию, но иной размер.
Для того, чтобы сравнить представленность генов катаболизма ксенобиотиков в разных биоценозах, помимо чистых культур ключевых почвенных доминантов были взяты пробы ила из лимана Горький Каневского района. В ил вносили поллютанты для индукции соответствующих катаболических ферментов – нефть и имдаклоприд в концентрации 625 г/л и 50 мг/л соответствено.
При изучении представленности гена алкенмонооксигеназы amoA было установлено, что при выбранном пороговом уровне флуоресценции, Ct в пробах ила, загрязненных нефтью, составило 30, а в пробах, в которые был внесен имидаклоприд – 29.
При изучении представленности гена атразинхлоргидролазы AtzA в донных отложениях было установлено, что при выбранном пороговом уровне флуоресценции, Ct в пробах ила, загрязненных нефтью составило 37, а в пробах, загрязненных имидаклопридом – 42, что косвенно свидетельствует о стимулировании нефтью синтеза данного гена.
В образцы загрязненных донных отложений поместили анод микробного топливного элемента бентосного типа, подключенный или не подключенный внешней цепью к катоду, который был размещен в слое воды над анодом. Это было сделано для проверки влияния биоэлектрохимических процессов на представленность исследуемого гена относительно гена 16S рРНК, показатели которого позволяют судить об общем количестве бактериальной биомассы в образце. Было установлено, что представленность гена AtzA относительно гена 16S в пробах ила, загрязненных нефтью и имидаклопридом выше на аноде, который не был подключен к катоду. Но на обоих анодах представленность гена атразинхлоргидролазы была выше, чем в иле.
Представленность гена алкенмонооксигеназы amoA относительно гена 16S рРНК на аноде, который был соединен с катодом имела другую зависимость от электрохимических условий и была выше, чем на неподключенном, но меньше, чем в иле между анодами.
Из проведенных исследований можно сделать вывод, что гены, ответственные за биодеградацию атразина и алкенов, встречаются и в почвенных биоценозах, и в биоценозах донных отложений, что свидетельствует о способности данных сообществ к самоочищению от данных веществ. При этом, их представленность в анаэробных микробиоценозах различным образом зависела от электрохимических условий селекции микрофлоры и присутствия поллютанта.